Nature | 窥探小细胞里的“大电影”——基于Cryo-ET可视化ER膜上翻译和蛋白质生物合成

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在哺乳动物细胞中，绝大多数膜蛋白、分泌蛋白和大多数细胞器的可溶性蛋白都是在内质网 (endoplasmic reticulum, ER) 膜上合成的。这些蛋白通过疏水性N端信号肽 (signal peptide, SP) 靶向ER。当新生的SP从核糖体中出现时，它结合可溶性信号肽识别颗粒 (SRP)，SRP被位于ER膜上的SRP受体识别，并介导核糖体—新生链复合物募集到ER，新生链继续在ER膜上延伸¹（图1）。在其延伸周期中，核糖体招募与mRNA密码子相匹配的tRNAs，在氨基酸和新生链之间形成肽键，并将mRNA-tRNA分子转移²。此外，tRNA并不能随意结合，而是需要延伸因子辅助，还需要专门的校对机制来保证解码的忠实性。在真核生物中，两种延伸因子：eEF1a和eEF2支持所需的tRNA运动和核糖体小亚基相对于大亚基的运动，并消耗GTP。

图 1 SRP介导新生肽链进入内质网³

ER膜上有一种称为移位子 (translocon) 的蛋白质复合体，其功能与新合成的多肽转移有关。核糖体与动态的ER移位复合物结合¹，其不变的核心模块是面向核糖体出口通道的异源三聚体蛋白传导通道SEC61。为了促进蛋白质的运输和容纳信号肽，SEC61可以从闭合到开放的构象中切换。此外，SEC61可以与不同的辅助因子结合，从而运输不同的底物。移位相关蛋白复合物 (translocon-associated protein complex, TRAP) 是一个异源四元跨膜蛋白复合物，支持许多信号肽的插入。已有研究显示TRAP与核糖体RNA (ribosomal RNA, rRNA) 扩增片段和核糖体亚单位蛋白38e的相互作用，但由于缺乏TRAP的原子模型，其分子细节仍未被充分了解。OSTA负责底物的共翻译N-糖基化，在哺乳动物细胞至少50%的易位子中观察到OSTA。虽然OSTA的结构及其与核糖体和SEC61之间的关系已被广泛研究，但其在天然条件下的相互作用，包括与生物生成辅助因子例如ER分子伴侣的相互作用仍不清楚。

2023年1月25日，荷兰乌得勒支大学Friedrich Förster实验室与Juliette Fedry实验室合作，在Nature期刊上发表了题为Visualization of translation and protein biogenesis at the ER membrane的论文。文章使用cryo-ET技术在HEK293F细胞上原位观察ER膜上的mRNA翻译和蛋白质成熟过程。区分了10个核糖体中间状态和4个移位子变体，以及2个移位子结合的伴侣，分辨率从4到10 Å，将ER膜上的多聚体及其下游移位和生物合成机制可视化。

图 2 原位捕获人类核糖体的状态及分布

研究者首先分析了核糖体的翻译状态，将观察到的颗粒分为十个不同的状态，并检查了各类颗粒的相对三维分布，表明它们被整合到多聚体中（图2a-c）。此外，为了评估此项结果的生理相关性，研究者用聚焦离子束 (FIB) 研磨的人类细胞分析了核糖体中间状态的原位分布。结果证实了真核延伸因子结合核糖体类的高丰度（约70%），并确定eEF1a和eEF2为核糖体结合因子。

为了进一步分析多聚体相关的核糖体类别，研究者试图将它们定位在先前体外重组研究所模拟的延伸周期的背景下（图2d）。虽然有一类不能确定其状态，其余七种状态与以前的结构或生化数据一致。在该数据中，大约有22%的核糖体采用非旋转状态，P位和E位的tRNA和eEF1a-tRNA三元复合体有明显的密度，将其归入解码状态（图2e）。出乎意料的是，研究者还观察到一个以前没有描述过的高含量的中间物（33%）：虽然tRNA被容纳在典型的A位，核糖体小亚基 (SSU)“滚动”到经典的预构象，但eEF1a以延伸的构象与核糖体结合（图2e）。为了在更高的分辨率下分析该状态，研究者使用冷冻电镜单颗粒分析 (SPA) 对其进行成像, 并对eEF1a进行局部重构，分辨率大约在3.5 Å。研究者提出, 在人类延伸周期的模型中，经典的pre+状态可能在解码状态之后，其中eEF1a仍采用紧凑的构象。这一结果与细菌不同，在细菌中，在丰富的pre-like A/P状态下没有原位观察到延伸因子，这表明真核生物水解后校对的差异，可能涉及eEF1A。

与膜结合的冬眠核糖体分为两个主要状态（图2f）。一个非旋转状态和在该数据中发现的另一个旋转的核糖体状态（5%）。其特征是eEF2，蛋白质CCDC124不在其中，与细胞膜冬眠核糖体类似。

图 3 可溶域和ER膜相关核糖体种群的构造

然后，研究者根据核糖体出口通道附近的结构特征将颗粒分为五个不同的类别（图3a）：一个可溶性核糖体类别和四个膜结合核糖体类别。之前已有研究确定了最多的SEC61-OSTA-TRAP（69%）和SEC61-TRAP移位子（10%）。剩下的两类（21%）的ER移位子有一个共同的较大成分，其中一个也含有TRAP。在原始断层图中将这些不同核糖体—移位子群的粒子映射回去，根据移位子类型进行聚类（图3c）。表明核糖体与含OSTA和多通道移位子以及可溶性EBP1结合有强烈的解离作用（图3d）。新生多肽在其生物合成的早期优先遇到SEC61-TRAP移位子，后来，膜结合移位子机械特异化，这与最近对不同模型底物的研究是一致的。

图 4 SEC61-OSTA-TRAP移位子的原子模型

以核糖体为中心对最丰富的群体SEC61-OSTA-TRAP移位子进行了优化，分辨率达到了4.2 Å。SEC61通道向脂质膜打开其侧门（图4a,b），侧门容纳了明显的螺旋密度，与分离物中信号肽的位置相吻合，可能代表了在ER膜上合成的不同蛋白质的信号肽的平均值。此外，在核糖体出口通道附近可以看出一个密度，可能对应于新生链的平均值。SEC61的腔体部分显示了一个短的α螺旋，将其归入SEC61 α plug（图4c）。研究者还揭示了TRAP α的位置，此外，还在膜的胞质表面看到了以前未发现的TRAP γ C端和SEC61 γ N端螺旋之间的接触（图4e）。该结构同时也为TRAP的作用机制提供了一种新的假说。

图 5共同翻译的ER生物合成因子和总结

研究者进一步对OSTA的SEC61近端腔面进行了分类，发现了三个不同的群体：（1）没有附属因子的OSTA（11%），（2）与大约35kDa的球状密度结合的OSTA（L1，54%），以及（3）与大约60kDa的密度结合的OSTA（L2，35%）（图5a, b）。

总的来说，冷冻断层数据的广泛分类可视化了ER相关翻译的过程和在多聚体背景下动态募集蛋白质生物合成因子的机制（图5c）。这项关于细胞内合成的分泌蛋白的研究补充了生化分析，并为今后研究特定蛋白质的生物合成以及不同细胞状态和疾病中机制的变化奠定了基础。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586

-022-05638-5

参考文献

参考文献

[1] Gemmer, M. & Förster, F. A clearer picture of the ER translocon complex. J. Cell Sci. 133, jcs231340 (2020).

[2] Voorhees, R. M. & Ramakrishnan, V. Structural basis of the translational elongation cycle. Annu. Rev. Biochem. 82, 203–236 (2013).

[3] Karamyshev AL, Tikhonova EB, Karamysheva ZN. Translational Control of Secretory Proteins in Health and Disease. Int J Mol Sci. 21(7):2538 (2020).

供稿 | 肖媛

审稿 | 谭佳鑫

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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